Rôles comportementaux des amines biogènes chez les bourdons mâles

Scientific Reports volume 12, Numéro d’article: 20946 (2022) Citer cet article

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Pour comparer les rôles comportementaux des amines biogènes chez les mâles des abeilles eusociales primitives et avancées, nous avons déterminé les niveaux de substances liées à la dopamine et à la pieuvre dans le cerveau, et les effets comportementaux de ces monoamines par injection de drogue chez le bourdon eusocial primitif, Bombus ignitus. Les niveaux de dopamine et de ses précurseurs dans le cerveau ont culminé à la fin du stade nymphal, mais le pic de dopamine s’est étendu à l’émergence adulte. Les niveaux de tyramine et de pieuvre ont augmenté du stade nymphal moyen au stade adulte. Les activités locomotrices et de vol, ainsi que la préférence pour la lumière, augmentaient avec l’âge. L’injection d’octopamine et de son antagoniste des récepteurs a eu des effets significatifs sur les activités locomotrices et de vol, contrairement à l’injection de dopamine, ce qui indique que ces activités peuvent être régulées par le système octopaminergique. Nous avons également déterminé la dynamique des substances liées à la dopamine dans les drones d’abeilles mellifères (Apis mellifera). Les changements dans le niveau de dopamine dans le cerveau des drones mellifères ont montré deux pics du stade nymphal au stade adulte, alors que les mâles bourdons n’avaient qu’un seul pic. Ceux-ci sont cohérents avec les fonctions comportementales de la dopamine dans les drones d’abeilles mellifères et l’inefficacité de l’injection de dopamine au stade adulte chez les mâles bourdons.

L’eusocialité est le système social le plus complexe, avec une division du travail entre les individus génétiquement apparentés, et elle a été signalée chez diverses espèces dans un large éventail de taxons d’insectes1,2,3,4. Chez les hyménoptères eusociaux, les comportements sociaux impliquant une coopération entre les membres de la colonie ne sont observés que chez les femmes. Les hyménoptères eusociaux mâles se spécialisent dans la reproduction et ne participent pas à la construction des nids, aux soins des couvées ou à la défense des colonies1,2,5, bien que les mâles chez les abeilles eusociales contribuent à la thermorégulation coloniale6,7. Par conséquent, les répertoires comportementaux des hommes sont beaucoup plus petits que ceux des travailleurs. L’étude des comportements des mâles et des mécanismes physiologiques associés peut fournir des informations importantes sur la spécialisation du comportement pour la reproduction chez les mâles dans des environnements très sociaux.

Dans des environnements eusociaux avancés, les comportements des drones abeilles mellifères (Apis mellifera) ont été étudiés dans divers domaines de recherche, notamment la génétique, l’endocrinologie, la biologie de la reproduction et la biologie évolutive8. Les drones mellifères mûrissent sexuellement pendant une semaine après l’émergence et commencent à voler pour s’accoupler avec des reines vierges5,9. Les activités locomotrices et de vol associées à la reproduction chez les drones augmentent avec l’âge au cours de leur maturation sexuelle10. Les bourdons domestiques retournent dans la colonie mère, tandis que les bourdons mâles n’apprennent pas l’emplacement de la colonie et ne reviennent jamais dans la colonie7,11,12. Après avoir quitté le nid, les mâles bourdons se nourrissent tout en cherchant des gynes pour s’accoupler. Cela peut être dû à la production mâle à la fin de la saison des colonies, lorsque l’état nutritionnel des colonies de bourdons diminue. Ainsi, la dépendance des mâles vis-à-vis de la colonie diffère entre l’abeille mellifère et le bourdon, ce qui pourrait refléter l’adaptation du comportement masculin à différents environnements sociaux.

Les amines biogènes sont des agents physiologiques qui fonctionnent comme neurotransmetteurs, neuromodulateurs et neurohormones chez diverses espèces d’insectes13,14,15,16,17. Ces substances sont impliquées dans la division du travail liée à l’âge chez les abeilles mellifères18,19 et le comportement reproducteur des reines vierges20,21. Dans les drones d’abeilles, les niveaux de dopamine et de pieuvre dans le cerveau augmentent avec l’âge10,22,23. L’injection de ces monoamines dans l’hémolymphe des drones améliore leurs activités locomotrices et de vol10,23. Par conséquent, l’augmentation des niveaux de dopamine et de pieuvre dans le cerveau peut être étroitement liée aux activités de vol d’accouplement dans les drones d’abeilles mellifères. La dopamine améliore également les activités locomotrices et de vol chez les mâles de l’abeille solitaire Xylocopa appendiculata24, qui partage un ancêtre commun chez les Apidae25. Ainsi, la régulation du comportement reproducteur mâle par les amines biogènes pourrait être partagée entre les abeilles eusociales et devrait être testée chez d’autres espèces au sein d’un clade monophylétique, comme les abeilles corbiculées.

Les bourdons comprennent un grand groupe d’abeilles eusociales primitives, et ce sont des espèces idéales pour étudier le chaînon manquant entre les espèces eusociales solitaires et avancées, bien que l’analyse multidimensionnelle des comportements sociaux suggère la petite différence de complexité sociale entre les abeilles mellifères et les bourdons26. Les bourdons mâles sont produits de la fin de l’été au début de l’automne par des colonies adultes dans les régions tempérées2,7. Le rôle principal des mâles bourdons dans la colonie est la reproduction, et ils peuvent s’accoupler avec différents gynes contrairement aux drones d’abeilles mellifères d’accouplement uniques. Les mâles bourdons terminent leur maturation sexuelle 6 à 9 jours après l’émergence et commencent l’accouplement avec des gynes27. Élucider les mécanismes physiologiques qui sous-tendent le comportement reproducteur des mâles bourdons et les comparer à ceux de l’abeille mellifère peut améliorer notre compréhension de l’adaptation du système de régulation du comportement reproducteur mâle à l’environnement social. Cependant, aucune étude antérieure n’a rapporté la régulation du comportement reproducteur par les amines biogènes chez les mâles bourdons. Ainsi, dans la présente étude, nous avons étudié la dynamique des niveaux d’amines biogènes dans le cerveau et les effets des amines biogènes sur le comportement reproducteur chez les mâles bourdons (B. ignitus). Nous avons également comparé les mécanismes chez le bourdon et l’abeille mellifère pour déterminer si les mécanismes médiés par les amines biogènes diffèrent entre les deux espèces.

Nous avons d’abord déterminé les niveaux de dopamine, d’octopamine et de leurs précurseurs dans le cerveau des pupes mâles et des adultes en utilisant la chromatographie liquide haute performance avec des systèmes de détection électrochimique (HPLC-ECD). Les taux de deux précurseurs de la dopamine (tyrosine et DOPA, Fig. 1A) ont augmenté avec l’âge au stade nymphal (P0–1 à P6–7), mais ont diminué avant l’émergence (P8–9 à A0) et sont ensuite restés à des niveaux constamment inférieurs au stade adulte (A2 à A8) par rapport à ceux au stade nymphal (tyrosine: Kruskal–Wallis: H = 106,500, df = 9, p < 0,001, acier–dwass: p < 0,05, fig. 1B; DOPA: Kruskal–Wallis: H = 88,300, df = 9, P < 0,001, Acier-Dwass: P < 0,05, Fig. 1C). Cependant, les niveaux de dopamine augmentaient avec l’âge au stade nymphal et sont restés aux niveaux les plus élevés de la fin de l’état nymphal (P8-9) à l’émergence adulte (A0), puis diminuant (A2-A8) (Kruskal-Wallis: H = 88,599, df = 9, P < 0,001, Steel-Dwass: P < 0,05, Fig. 1D). Les changements dans les niveaux de dopamine étaient fondamentalement similaires à ceux dans les niveaux de tyrosine et de DOPA, mais la diminution du niveau de dopamine après l’émergence a été retardée par rapport aux diminutions des précurseurs de la dopamine.

Changements liés à l’âge dans les substances liées à la dopamine normalisés par les protéines cérébrales chez les mâles bourdons. (A) Voie synthétique pour les substances liées à la dopamine. Les niveaux de tyrosine (B), DOPA (C) et de dopamine (D) sont montrés dans le cerveau. Les barres d’erreur indiquent les erreurs standard. Les différences significatives selon l’essai Steel-Dwass (P < 0,05) sont indiquées par différentes lettres. La taille des échantillons est indiquée entre parenthèses.

La tyramine est un métabolite de la tyrosine, un précurseur de la pieuvamine et a sa propre fonction chez les insectes15,28 (Fig. 2A). Les niveaux de tyramine sont restés constants pendant le stade nymphal, ont augmenté de la fin du stade nymphal (P8–9) à l’émergence adulte (A0), et sont restés à des niveaux plus élevés au stade adulte (A0–A8) qu’au stade nymphal (Kruskal-Wallis : H = 79,481, df = 9, P < 0,001, Steel–Dwass : P < 0,05, Fig. 2B). Les niveaux de pieuvre ont augmenté du stade nymphal moyen (P4–5) au stade adulte (Kruskal-Wallis : H = 80,097, df = 9, P < 0,001, Steel–Dwass : P < 0,05, Fig. 2C). Ainsi, les niveaux de deux phénolamines (tyramine et octopamine) dérivées de la tyrosine ont augmenté progressivement avec l’âge du stade nymphal au stade adulte.

Changements dépendants de l’âge dans les substances liées à la pieuvre normalisés par les protéines cérébrales chez les mâles bourdons. A) Voie synthétique pour les substances apparentées à l’octopamine. Les niveaux de tyramine (B) et de pieuvre (C) sont indiqués. Les barres d’erreur indiquent les erreurs standard. Les différences significatives selon l’essai Steel-Dwass (P < 0,05) sont indiquées par différentes lettres. La taille des échantillons est indiquée entre parenthèses.

Pour étudier les changements dans les activités comportementales avec l’âge, les activités locomotrices et de vol des mâles bourdons ont été mesurées à différents âges. L’activité locomotrice a augmenté de manière significative de A0 à A4 et est ensuite restée à des niveaux constamment plus élevés (Kruskal-Wallis: H = 46,139, df = 4, P < 0,001, Steel-Dwass: P < 0,05, Fig. 3A). La proportion d’individus qui marchaient dans la chambre en forme d’anneau est passée de A0 à A4, avec jusqu’à 100% à A6 et A8 (test exact de Fisher avec correction de Bonferroni: P < 0,05, Fig. 3B). L’activité de vol augmentait significativement avec l’âge parallèlement à l’activité locomotrice (test exact de Fisher avec correction de Bonferroni : P < 0,05, Fig. 3C). La durée de résidence dans la zone rouge diminuait significativement avec l’âge (Kruskal-Wallis : H = 19,634, df = 4, P < 0,001, Steel–Dwass : P < 0,05, Fig.3D), indiquant ainsi que les mâles préféraient progressivement la zone claire avec l’âge.

Changements liés à l’âge dans les activités comportementales chez les mâles bourdons: (A-B) activité locomotrice spontanée, (C) activité de vol spontanée et (D) préférence lumineuse indiquée par la durée de résidence dans la zone rouge. L’activité locomotrice et la durée de résidence dans la zone rouge sont indiquées par des diagrammes en boîte. Des différences significatives selon le test de Steel-Dwass (P < 0,05) ou le test exact de Fisher avec corrélation de Bonferroni (P < 0,05) sont indiquées par différentes lettres. La taille des échantillons est indiquée entre parenthèses.

Pour déterminer les effets de la dopamine sur le comportement, nous avons mesuré les activités locomotrices et de vol et la préférence lumineuse sur les mâles injectés de dopamine. L’activité locomotrice ne différait pas significativement entre les individus témoins et dopaminergiques injectés (Kruskal-Wallis : H = 4,705, df = 3, P = 0,195, Fig. 4A). La latence d’initiation du vol ne différait pas significativement entre les individus témoins et dopaminergiques injectés (Kruskal-Wallis : H = 4,354, df = 3, P = 0,226, Fig. 4B). La durée de résidence dans la zone rouge ne différait pas significativement entre les individus témoins et dopaminergiques (Kruskal-Wallis : H = 1,209, df = 3, P = 0,751, Fig. 4C). Ainsi, l’injection de dopamine n’a pas affecté les activités locomotrices et de vol et la réponse à la lumière chez les mâles.

Effets de l’injection de dopamine sur les activités comportementales des mâles de 4 jours chez le bourdon: (A) activité locomotrice spontanée, (B) durée de l’initiation du vol et (C) durée du temps résidant dans la zone rouge comme indice de préférence lumineuse. L’activité locomotrice, la durée d’initiation et la durée de résidence dans la zone rouge sont indiquées par des diagrammes en boîte. La taille des échantillons est indiquée entre parenthèses.

L’activité locomotrice était significativement plus élevée chez les individus traités par 10–3 M d’octopamine que chez les individus témoins (test de Kruskal-Wallis : H = 8,764, df = 3, P < 0,05 ; Acier: P < 0,05, Fig. 5A). Une tendance similaire a été observée chez les mâles traités par 10–4 M d’octopamine, mais aucune différence significative par rapport aux mâles témoins n’a été détectée. La latence d’initiation du vol ne différait pas significativement entre les individus témoins et les individus injectés à la pieuvre (Kruskal-Wallis : H = 1,315, df = 3, P = 0,726, Fig. 5B). La durée de résidence dans la zone rouge ne différait pas significativement entre les individus témoins et les individus injectés à la pieuvre (Kruskal-Wallis : H = 0,976, df = 3, P = 0,807, Fig. 5C).

Effets de l’injection d’octopamine sur les activités comportementales des mâles de 4 jours chez le bourdon: (A) activité locomotrice spontanée, (B) durée de l’initiation du vol, (C) durée de résidence dans la zone rouge comme indice de préférence lumineuse. L’activité locomotrice, la durée d’initiation et la durée de résidence dans la zone rouge sont indiquées par des diagrammes en boîte. Une différence significative selon le test de l’acier (P < 0,05) est indiquée par un astérisque. La taille des échantillons est indiquée entre parenthèses.

L’activité locomotrice des mâles 15 min après l’injection d’épinastine était significativement inférieure à celle du témoin (Mann-Whitney U : Z = 3,304, P < 0,001, Fig. 6A). L’activité des mâles ne différait pas entre les mâles témoins et traités 24 h après l’injection (Mann-Whitney U: Z = 1,447, P = 0,148, Fig. 6A), indiquant la récupération de l’inhibition par l’épinastine. La latence d’initiation du vol chez les mâles à 15 minutes après l’injection d’épinastine était significativement plus longue que chez les mâles témoins (Mann-Whitney U : Z = 2,573, P < 0,05, Fig. 6B), et la latence chez les mâles s’est rétablie de l’inhibition 24 h après l’injection et ne différait pas entre les mâles témoins et traités (Z = 0,534, P = 0,593, Fig. 6B). La durée de résidence dans la zone rouge ne différait pas significativement entre les mâles témoins et traités (15 min : Mann-Whitney U : Z = 0,829, P = 0,407 ; 24 h : Z = 1,328, P = 0,184, Fig. 6C).

Effets de l’injection d’épinastine (antagoniste des récepteurs de la piepamine) sur les activités comportementales des mâles de 4 jours chez le bourdon: (A) activité locomotrice spontanée, (B) durée de l’initiation du vol, (C) durée de résidence dans la zone rouge comme indice de préférence lumineuse. L’activité locomotrice, la durée d’initiation et la durée de résidence dans la zone rouge sont indiquées par des diagrammes en boîte. Les différences significatives entre les groupes traités à l’épinastine et les groupes témoins ont été évaluées à l’aide du test U de Mann-Whitney. Les durées d’initiation du vol sont agrandies dans les cases (bordure en pointillés bleu). Les chiffres en barres indiquent la taille des échantillons.

Il n’y a pas eu de rapports antérieurs sur les niveaux de dopamine dans le cerveau des drones d’abeilles mellifères pendant le stade nymphal, nous avons donc déterminé les niveaux de substances liées à la dopamine dans le cerveau des pupes de drones. Les changements dans les niveaux de deux précurseurs de la dopamine (tyrosine et DOPA) et de la dopamine présentaient des tendances similaires, et ils dépendaient de l’âge pendant le stade nymphal (Fig. 7A, B, C). Les concentrations de ces substances augmentaient significativement avec l’âge et culminaient juste avant l’émergence (P10–11), puis diminuaient à l’âge adulte (tyrosine : Kruskal–Wallis : H = 38,542, df = 5, P < 0,001 ; Acier-Dwass: P < 0,05, Fig. 7A; DOPA: H = 35,346, df = 5, P < 0,001; Acier-Dwass: P < 0,05, Fig. 7B; dopamine: H = 51,459, df = 5, P < 0,001; Acier-Dwass: P < 0,05, Fig. 7C). Un pic de dopamine vers l’âge de 8 jours a été signalé chez les drones adultes chez l’abeille mellifère22, de sorte qu’il est apparu que les niveaux de dopamine dans le cerveau avaient deux pics du stade nymphal au stade adulte.

Changements dépendants de l’âge dans les substances liées à la dopamine normalisés par les protéines cérébrales dans les drones d’abeilles mellifères au stade nymphal. Les changements dans les niveaux de tyrosine (A), les niveaux de DOPA (B) et les niveaux de dopamine (C) sont montrés. Les barres d’erreur indiquent les erreurs standard. Les différences significatives selon l’essai Steel-Dwass (P < 0,05) sont indiquées par différentes lettres. La taille des échantillons est indiquée entre parenthèses sous l’âge.

L’étude des mécanismes physiologiques qui sous-tendent le comportement reproducteur des mâles a été nécessaire pour les espèces de clades monophylétiques telles que les abeilles corbiculées. Dans les drones d’abeilles, la modulation du comportement de reproduction par les amines biogènes a été étudiée8,10,23. Cependant, il n’y a pas eu de rapports antérieurs sur les niveaux d’amines biogènes dans le cerveau et les tests comportementaux par application d’amines biogènes chez les mâles bourdons. La présente étude est la première détermination des fonctions de la dopamine et de l’octopamine dans les activités comportementales des mâles chez une abeille eusociale primitive.

Chez les mâles bourdons, le niveau de piepamine dans le cerveau a augmenté du stade nymphal moyen au stade adulte. Les activités locomotrices et de vol chez les mâles adultes augmentaient également avec l’âge jusqu’à l’âge sexuellement mature (8 jours). Ces résultats suggèrent que l’octopamine est une substance neuroactive potentielle qui coïncide avec l’augmentation des activités comportementales liée à l’âge. Nous avons ensuite testé les effets des amines biogènes sur les activités comportementales par injection de drogue. L’injection d’octopamine a augmenté l’activité locomotrice, tandis que l’épinastine a diminué l’activité locomotrice et augmenté la latence de l’initiation du vol. Étant donné que l’épinastine agit à travers les récepteurs de la piepamine en tant qu’antagoniste, les résultats indiquent que le blocage de la signalisation octopaminergique diminue les activités locomotrices et de vol, et par conséquent, l’octopamine améliore ces activités chez les mâles bourdons. Dans les drones d’abeilles mellifères, les niveaux cérébraux d’octopamine et d’activités locomotrices et de vol augmentaient avec l’âge10,23. L’injection d’octopamine a amélioré l’activité de vol dans les drones23. Les changements dans les niveaux de piepamine et les fonctions comportementales de l’octopamine ont été partagés entre les mâles bourdons et les drones d’abeilles mellifères.

Contrairement à l’octopamine, les niveaux de dopamine dans le cerveau au stade adulte ont diminué immédiatement après l’émergence adulte et l’injection de dopamine n’a pas affecté les activités comportementales chez les mâles bourdons. Ces résultats suggèrent que la dopamine n’est pas impliquée dans l’augmentation des activités comportementales des mâles bourdons au moins au jour 4 de la vie adulte.

Nous avons déterminé les changements dans les niveaux de dopamine dans le cerveau des drones mellifères au cours des stades nymphaux pour les comparer à ceux des mâles bourdons. Les niveaux de dopamine dans les pupes d’abeilles mellifères augmentaient avec l’âge et atteignaient un sommet immédiatement avant l’émergence adulte (P10–11). Il a déjà été rapporté que les niveaux de dopamine au stade adulte augmentaient avec l’âge et culminaient à 8 jours après l’émergence10,22. Par conséquent, les niveaux de dopamine dans le cerveau des drones d’abeilles mellifères avaient deux pics du stade nymphal au stade adulte (Fig. 8, ligne rouge). Contrairement aux deux pics des niveaux de dopamine chez les drones mellifères, les niveaux de dopamine chez les mâles bourdons n’ont culminé qu’une seule fois du stade moyen du stade nymphal au début de l’adulte (Fig. 8, ligne bleue). Cette différence dans les changements dans le niveau de dopamine au stade adulte entre ces deux espèces peut fournir un aperçu important du processus évolutif d’un ancêtre commun à deux espèces. Chez les drones mellifères, la dopamine améliore les activités locomotrices et de vol10,23, qui correspondent à un pic du niveau de dopamine à l’âge sexuellement mature (A8). Chez les insectes solitaires, la dopamine améliore l’activité locomotrice et le comportement sexuel chez D. melanogaster29,30,31, ainsi que les activités locomotrices et de vol chez la grande abeille charpentière, X. appendiculata24. Ces résultats suggèrent que les effets de la dopamine sur les activités locomotrices et de vol pourraient être partagés entre les mâles de plusieurs espèces solitaires et l’abeille mellifère, mais pas chez le bourdon. Il faut déterminer si la caractéristique ancestrale est un ou deux pics de dopamine du stade nymphal au stade adulte sexuellement mature.

Comparaison des changements dans les niveaux de dopamine dans le cerveau des mâles abeilles mellifères et bourdons. Les lignes rouges et bleues indiquent les niveaux de dopamine dans l’abeille mellifère (Apis mellifera) et le bourdon (Bombus ignitus), respectivement. Les données sur la dopamine pour l’abeille mellifère ont été obtenues dans la présente étude et les études de Harano et al.22 et Watanabe et Sasaki32.

Les effets de la dopamine sur les activités locomotrices et de vol chez les bourdons mâles peuvent avoir été perdus ou inutilisés avec un manque de pic de dopamine au stade adulte. Chez les drones mellifères, le pic de dopamine au début de l’âge adulte est généré par les effets de l’hormone juvénile (JH) et des apports alimentaires8. Le titre JH dans l’hémolymphe augmente avec l’âge jusqu’à la maturation sexuelle comme les niveaux de dopamine dans le cerveau22,33,34. JH améliore l’expression génique des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la dopamine et augmente les niveaux de dopamine dans le cerveau22,23,32,35. Chez les mâles bourdons, le titre JH peut ne pas augmenter au début de l’âge adulte et ne pas stimuler la biosynthèse de la dopamine. La consommation d’aliments contenant de la tyrosine provenant d’abeilles nourrices peut également améliorer l’expression génique des enzymes de la biosynthèse de la dopamine et augmenter les niveaux de dopamine au début de l’âge adulte chez les drones d’abeilles32,36. Les mâles adultes du bourdon ne reçoivent pas de nourriture des travailleurs et peuvent avoir moins d’occasions de consommer de la tyrosine que les bourdons d’abeilles. Cela peut être une autre raison de l’absence d’une augmentation de la dopamine.

Cette étude a étudié les relations entre les amines biogènes et le comportement de reproduction des mâles bourdons (B. ignitus). Nous avons également comparé les mécanismes associés chez le bourdon et l’abeille mellifère pour obtenir des informations sur l’évolution de la régulation du comportement reproducteur. Le taux de piepamine dans le cerveau augmentait avec l’âge chez les adultes parallèlement aux activités locomotrices et de vol et à la préférence lumineuse, alors que le niveau de dopamine ne le faisait pas. L’injection d’octopamine et d’épinastine a affecté les activités locomotrices et de vol de manière opposée, mais pas la dopamine. Ces résultats suggèrent que le système octopaminergique améliore les activités locomotrices et de vol impliquées dans le comportement reproducteur des mâles bourdons. Il a été rapporté que la dopamine et l’octopamine favorisent l’activité de vol des drones d’abeilles. Par conséquent, la fonction de l’octopamine dans la promotion du vol a été partagée entre les mâles bourdons et abeilles mellifères, mais la fonction comportementale de la dopamine avec augmentation de la dopamine n’a pas été observée chez les mâles bourdons.

Les colonies de bourdons élevés commercialement (B. ignitus) ont été gardées dans des boîtes en bois selon la procédure décrite par Sasaki et al.37,38. Les pupes mâles ont été collectées dans des cocons dans 12 colonies de reines. Pour identifier l’âge nymphal, nous avons défini une nymphe mâle blanche avec des yeux composés blancs comme une nymphe de 0 à 1 jour (P0-1). Nous avons transféré des pupes âgées de 0 à 1 jour dans des gobelets en plastique (Φ98 mm × 96 mm) conservés à 28 °C dans des conditions d’obscurité constante, puis nous les avons collectées à 0–1, 2–3, 4–5, 6–7 et 8–9 jours après la nymphose. Les mâles adultes nouvellement émergés (mâles de 0 jour) ont été marqués sur le thorax avec de la peinture (Paint Marker, Mitsubishi, Japon) pour identifier leur âge. Les mâles marqués ont été retournés dans les colonies mères et recueillis dans les colonies à un âge spécifique. Les mâles collectés ont été utilisés pour mesurer les niveaux d’amines biogènes dans le cerveau et pour des expériences comportementales. Les échantillons utilisés pour mesurer les niveaux d’amines biogènes ont été prélevés entre 11h00 et 13h30. Ils ont été euthanasiés avec de l’azote liquide et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à leur analyse.

Les pupes et les adultes nouvellement émergés de drones d’abeilles mellifères (A. mellifera) ont été obtenus à partir de colonies normales de royales conservées dans un rucher de l’Université Tamagawa, à Tokyo, au Japon. Pour obtenir des pupes de drones, des cadres de peigne avec des surfaces égales de bases de peignes de drones et de travailleurs ont été introduits dans les colonies pour permettre aux travailleurs de construire des cellules de peigne sur eux. Après le bouchage des cellules de peigne du drone, les cadres ont été prélevés dans les colonies et transférés dans un incubateur maintenu à 33 ° C. L’âge nymphal a été déterminé en fonction de la méthode décrite par Jay39. Des adultes nouvellement émergés ont également été collectés à partir des cellules de peigne de drone. Les pupes et les drones adultes nouvellement apparus ont été collectés entre 11h00 et 13h30, euthanasiés avec de l’azote liquide et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à ce que des substances liées à la dopamine soient mesurées.

Les têtes du bourdon et de l’abeille mellifère stockées dans de l’azote liquide ont été disséquées dans un tampon phosphate de 0,1 M (pH 7,0) sur une unité de refroidissement Peltier (Kenis Ltd, Osaka, Japon) à environ 4 °C au microscope. Les cerveaux disséqués ont été homogénéisés pendant 2 min avec des homogénéisateurs de microverre dans 100 μL d’acide perchlorique 0,1 M glacé contenant 0,1 ng/μL de 3,4-dihydroxybenzylamine. Chaque échantillon a ensuite été transféré dans un tube microcentrifugé de 1,5 mL et centrifugé à 15 000 × g et à 4 °C pendant 30 minutes. Chaque surnageant a été transféré dans des microflacons pour analyse par des systèmes HPLC-ECD.

Le système HPLC-ECD utilisé pour mesurer les niveaux de dopamine, d’octopamine et de tyramine mis au point par Sasaki et coll.40 comprenait une pompe de distribution de solvant (PU-4180, Jasco, Tokyo, Japon), un injecteur automatique réfrigéré (AS-4050, Jasco) et une colonne en phase inversée C18 (250 mm × 4,6 mm d’id, taille moyenne des particules de 5 μm; UG120, Osaka Soda, Osaka, Japon), et la température a été maintenue à 35 °C. L’ECD (ECD-700, EICOM, Kyoto, Japon) a été réglé à 0,85 V et utilisé à 35 °C. La phase mobile contenait 0,18 M d’acide monochloroacétique et 40 μM de 2Na-EDTA, qui a été ajusté à pH 3,6 avec NaOH, et 1,62 mM de sodium-1-octanesulfonate et 5% de CH3CN ont été ajoutés à cette solution. Le débit a été maintenu constant à 0,7 mL/min.

Le système HPLC-ECD utilisé pour mesurer les niveaux de tyrosine et de 3,4-dihydroxyphénylalanine (DOPA) mis au point par Matsuyama et coll.41 comprenait une pompe de distribution de solvant (AS-4580, Jasco), un injecteur automatique réfrigéré (AS-4550, Jasco) et une colonne en phase inversée C18 (250 mm × 4,6 mm d’id, taille moyenne des particules de 5 μm; MG, Osaka Soda), et la température a été maintenue à 35 °C. L’ECD (ECD-700, EICOM) a été réglé à 0,84 V et utilisé à 35 °C. La phase mobile contenait 83 mM d’acide citrique monohydraté, 17 mM d’acétate de sodium, 13 μM de 2Na-EDTA et 2,3 mM de sodium-1-octanesulfonate, et 7% de méthanol ont été ajoutés à cette solution. Le débit a été maintenu constant à 0,7 mL/min. Dans les deux systèmes HPLC-ECD, des étalons externes ont été exécutés avant et après les essais d’échantillonnage pour identifier et quantifier les amines biogènes. Les pics ont été identifiés en comparant le temps de rétention et les voltammogrammes hydrodynamiques avec ceux obtenus pour les étalons. Les mesures basées sur les aires des pics dans les chromatogrammes ont été obtenues en calculant le rapport de l’aire des pics pour une substance par rapport à la surface des pics pour l’étalon.

Pour normaliser les niveaux d’amines biogènes en fonction de la teneur en protéines dans le cerveau, les quantités de protéines ont été mesurées à l’aide de la méthode de Bradford42. La pastille de protéine précipitée obtenue à partir du tissu cérébral après extraction des amines biogènes a été traitée avec les mêmes procédures que celles décrites par Sasaki et al.40. L’absorbance de chaque échantillon réagi a été mesurée à une longueur d’onde de 590 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (MPR-A100, AS ONE, Osaka, Japon).

Les mâles prélevés dans les colonies mères ont été transférés individuellement dans une chambre en forme d’anneau (diamètre extérieur 150 mm; diamètre intérieur 90 mm) avec un couvercle transparent à 28 °C jusqu’à l’expérience comportementale (Fig. S4). Les expériences comportementales ont été menées comme décrit par Sasaki et al.43. La feuille de couverture transparente a été séparée en quatre divisions par un réticule, puis recouverte d’une feuille de plastique rouge sur la moitié de la couverture transparente pour fournir une zone sombre (rouge) aux insectes dans la chambre. Après une acclimatation de 5 min, l’activité locomotrice spontanée de chaque abeille a été enregistrée à l’aide d’une caméra vidéo numérique pendant 15 min. Le nombre de croix du réticule a été compté dans l’enregistrement des données vidéo. De plus, les personnes qui ne bougeaient pas et qui marchaient étaient comptées. La durée de résidence sous la bâche de plastique rouge a été enregistrée pour déterminer la préférence pour la lumière. Après avoir mesuré l’activité locomotrice et les préférences lumineuses, la latence d’initiation du vol a été mesurée dans une cage en filet (45 cm × 60 cm × 45 cm) à 28 °C, comme décrit par Sasaki et al.43 (Fig. S4). La chambre contenant un mâle a été entièrement recouverte d’une bâche en plastique rouge et transférée dans la cage en filet. La feuille rouge a ensuite été retirée pour permettre au mâle de voler spontanément. Le comportement de vol pendant l’observation pendant 5 minutes après avoir retiré la feuille rouge a été classé selon deux niveaux : « ne pas voler » (y compris le battement d’ailes) et « voler ». La latence de l’initiation du vol a été enregistrée pour les individus « volants ».

Deux μl de solution de dopamine (Sigma-Aldrich) et d’octopamine (Sigma-Aldrich) (10–4, 10–3 et 10–2 M) ont été dissous dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) ou 2 μl de tampon phosphate 0,1 M (témoin). L’épinastine (TCI, Tokyo, Japon, antagoniste des récepteurs de l’octopamine44,45) a été dissoute dans un tampon phosphate 0,1 M à une concentration de 10–2 M. Pour examiner les rôles des amines biogènes dans la locomotion, la préférence lumineuse et les comportements de vol des mâles bourdons, des solutions préparées ont été injectées dans l’abdomen de mâles âgés de 4 jours à l’aide d’une microseringue de 10 μL avec une aiguille fine. La durée de l’acclimatation était de 15 min après l’injection du médicament avant d’observer les activités locomotrices.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel R (ver. 4.1.2, https://cran.r-project.org/). Les niveaux d’amines biogènes ont été comparés entre les groupes en utilisant le test de Kruskal-Wallis suivi du test de Steel-Dwass pour les comparaisons par paires. Les activités locomotrices et les durées de résidence dans la zone rouge ont également été analysées à l’aide du test de Kruskal-Wallis suivi du test de Steel-Dwass. Les proportions d’activités locomotrices (« ne bouge pas » par rapport à « marche ») et de vol (« ne pas voler » par rapport à « voler ») ont été examinées à l’aide du test exact de Fisher avec correction de Bonferroni. Les activités comportementales des hommes ont été examinées à l’aide du test de Kruskal-Wallis suivi du test de Steel (contrôle vs traitements). Les activités comportementales des hommes traités avec ou sans épinastine ont été comparées à l’aide du test U de Mann-Whitney.

Toutes les données utilisées dans la présente étude sont disponibles dans le document et ses documents supplémentaires.

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Cette étude a été soutenue par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) KAKENHI [numéros de subvention JP20K06077] à KS.

École supérieure d’agriculture, Université Tamagawa, Machida, Tokyo, 194-8610, Japon

Tomohiro Watanabe et Ken Sasaki

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K.S. et T.W. ont conçu l’étude. K.S. et T.W. ont conçu les expériences. T.W. a effectué les expériences. K.S. et T.W. ont analysé les données. T.W. a écrit le texte principal du manuscrit et K.S. a révisé et édité le manuscrit.

Correspondance avec Ken Sasaki.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Watanabe, T., Sasaki, K. Rôles comportementaux des amines biogènes chez les mâles bourdons. Sci Rep 12, 20946 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25656-7

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Reçu: 20 septembre 2022

Acceptée: 02 décembre 2022

Publication : 5 décembre 2022

DEUX : https://doi.org/10.1038/s41598-022-25656-7

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